PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記）

產品關鍵詞：

PKH67；PKH26；Calcein AM鈣黃綠素；PKH67；CFDA SE；In vivo cell tracking體內細胞示蹤；Sigma MINI26；Phanos Technologies；

產品信息

【好消息】：應客戶的要求，我司對試劑盒內的Diluent C可單獨供應，產品信息如下：

產品描述

PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記）（PKH67 Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling）是一款基于熒光探針PKH67，用于常規細胞膜標記的檢測試劑盒，適用于體外細胞標記，體外細胞增殖以及長期的體內細胞跟蹤研究等。

PKH67是一種專li的膜標記探針，與PKH1和PKH2相比，結構上帶有更長的脂肪族碳尾，能穩定插入細胞膜脂質區域。正因具更長碳尾，內部數據連續性證明：PKH67具有比PKH2更低的細胞-細胞間轉運發生。PKH67呈綠色熒光（見圖1），最大激發波長為490nm，最大發射波長是502nm，與標準熒光素（Fluorescein）濾片兼容。PKH67非常適合用于細胞毒性實驗，與碘化丙啶（PI，MX4205）或7-氨基放線jun素D（7-AAD，MX4215）這些細胞活力探針聯合使用，或者與橙-紅色熒光探針比如藻紅蛋白（PE，MX4698）、紅色熒光蛋白（RFP）等結合使用。根據染料稀釋原理，PKH67常用于細胞增殖監測分析，包括抗原特異性的前體頻率和帶干細胞特性的靜息/緩慢分化腫瘤細胞的鑒定。也能用于監測外泌體或脂質體吞噬，細胞-細胞膜轉運、吞噬、抗原遞呈，以及體內細胞運輸研究。

以不分裂細胞為研究對象，通過對體外細胞膜滯留周期和體內熒光強度減弱頻率的關聯性分析，預測PKH67的體內熒光半衰期為10-12天。這與PKH1和PKH2的體內半衰期相近，這兩個探針都成功用于監測周期長達1-2個月的體內淋巴細胞和巨噬細胞運輸研究，因此，PKH67適用于需要綠色熒光細胞連接染料的短-中期體內示蹤研究，以及體外細胞毒性、吞噬、增殖、抗原遞呈，或其它共培養實驗。

稀釋液C（Diluent C）是本試劑盒配套提供的一種水溶性溶液，特別設計的一種標記媒介能維持細胞活力，同時zui大化染料溶解性和標記過程中的染色效率。Diluent C對哺乳動物細胞來說是等滲的，不含去污劑或有機溶劑，也不含生理鹽和緩沖劑。根據細胞類型，染料標記后膜的內在化程度，標記細胞可能呈現不同的狀態，從明亮，到均勻點狀或斑駁狀。然而，PKH67熒光在生理范圍內不依賴于pH，且每個細胞的熒光強度通常不受染料位置的影響。

圖1. PKH67的激發和發射光譜圖

我司（懋康生物）提供三種規格的PKH67細胞連接試劑盒（用于常規細胞膜標記），其中：

Mini Kit（CAT#：MX4023-100UL）建議用于小量或初步研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測25次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于5次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定的染料濃度。

Midi Kit（CAT#：MX4023-200UL）適用于中量研究，比如體外細胞增殖或毒性研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測50次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定的染料濃度。

Maxi Kit（CAT#：MX4021-500UL）適用于大量或體內研究。當使用2ml染色體積（含2μM終濃度的PKH67），本試劑盒含有足量的染料用于檢測125次細胞樣本（2×107個細胞/次），和足量的Diluent C用于30次細胞樣本（2×107個細胞/次）。用戶需根據細胞類型和實驗目的來優化確定的染料濃度。

產品包裝

保存與運輸方法

保存：2-8oC避光保存，1年有效。其中組分A（PKH67 Dye）需嚴格避光，蓋子保持擰緊。

運輸：冰袋運輸。

注意事項

1. PKH67是以溶于乙醇的儲存液形式提供，保存的過程中需避光并擰緊蓋子，以防止溶液揮發引起的染料濃度提高。使用前需檢查是否有結晶，若有結晶，需在37℃水浴溶晶，超聲或渦旋直至完quan溶解。

2. Diluent C使用前需置于室溫回溫之后再配制標記用的細胞和染料工作液。Diluent C是無菌溶液，不含任何防腐劑或抗生素，使用和保存過程中都注意無菌。

3. PKH67不能保存在Diluent C內，保存在Diluent C的染色工作液需在使用前配制，現配現用。

4. 熒光染料均存在淬滅問題，操作和儲存過程中需注意避光，以減緩熒光淬滅。

5. 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作步驟

1. 自行準備儀器和試劑（試劑盒不提供，用于常規細胞膜標記）

﹒良好分散，均勻的單細胞懸液（懸浮于組織培養基）

﹒含血清的組織培養基（完quan培養基）

﹒不含Ca2+、Mg2+和血清的培養基，或生理鹽溶液（比如，DPBS或HBSS）

﹒血清，白蛋白或其他系統兼容的蛋白

﹒聚丙烯錐底離心管（4-15ml）

﹒能控溫的離心機（高達1000×g）

﹒熒光分析用儀器（熒光酶標板，熒光或共聚焦顯微鏡，流式細胞儀）

﹒無菌層流凈化罩

﹒血球計數板或自動細胞計數裝置

﹒載玻片和蓋玻片

2. 常規細胞膜標記

【染色流程】：

以下操作流程使用2ml最終染色體積，含2μM PKH67，以及1×107個細胞/ml。

以下所有步驟都在室溫下進行（20-25℃）。

1. 取一錐底聚丙烯離心管制備2×107個細胞的單細胞懸浮液，用無血清培養基清洗細胞一次。

2. 400×g離心細胞5min，得到松散的細胞沉淀。

3. 細胞離心后，輕輕吸掉上清。注意不要移動任何細胞并且殘留不超過25μl上清液。

4. 加1ml Diluent C到細胞沉淀中制備成2×細胞懸液，用槍輕輕吹勻以確保完quan分散。不可渦旋和不可讓細胞長期保留在Diluent C中。

5 染色前立即制備2×染色液（4μM in Diluent C）：通過將4μl PKH67乙醇儲存液到1ml Diluent C中，充分混勻分散所得。

6. 快速加1ml2×細胞懸液（Step 1.4）到1ml2×染色液（Step 1.5），用槍立即混勻樣本。混勻后樣本得到的終濃度是1×107個細胞/ml和2μM PKH67。

7. Step 1.6中的細胞/染料懸液孵育1-5min，中間定期混合。染色過程非常快，更長時間無任何益處。

8. 加入等體積（2ml）血清或其他適當蛋白溶液（比如1% BSA）終止染色，孵育1min允許結合多余的探針。

9. 20-25℃，400×g離心細胞10min，輕輕吸掉上清，確保不會移動細胞。用10ml完quan培養基重懸細胞，轉移到一個干凈無菌的錐底聚丙烯離心管中，20-25℃，400×g離心細胞5min。然后用10ml完quan培養基清洗細胞沉淀＞2次，以確保完quan去除未結合染料。

10. 最后一步清洗后，用10ml完quan培養基重懸細胞沉淀，用來評估細胞回收，細胞活力和染色強度。離心和重懸沉淀到一理想終濃度的活細胞懸液。

染色示例（來自文獻資源）

1）文獻來源：Kelly DM, ten Bokum AM, O'Leary SM, O'Sullivan MP, Keane J. Bystander macrophage apoptosis after Mycobacterium tuberculosis H37Ra infection. Infect Immun. 2008;76(1):351-360. doi:10.1128/IAI.00614-07

PKH67染色目的（MKBIO）：為了評估旁觀者凋亡效應，靶向THP-1單核細胞用PKH67來標記，最終在熒光顯微鏡觀察以確認標記是否成功。標記好的THP-1細胞（未感染的旁觀者細胞量：0.5 × 105cells/ml），加入被H37Ra感染的THP-1巨噬細胞（感染效應細胞量：0.5 × 105cells/ml），接種到2孔的LabTek腔室玻片。效應巨噬細胞經H37Ra感染4h，之后劇烈清洗去除胞外細菌。之后與未感染的PKH67標記旁觀者細胞共培養，37℃共培養24或48h。孵育后，上清液去除，細胞用2% PFA固定，然后用TUNEL TMR監測凋亡，細胞核用Hochest 33342復染。用熒光顯微鏡來評估綠色PKH67標記巨噬細胞的旁觀凋亡效應。當某一個單細胞同時呈綠色（旁觀者）和紅色（凋亡），表明旁觀者凋亡效應的存在。

Fig 2. Uninfected bystander apoptosis for macrophages that were in contact with infected macrophages. (A) Macrophages were infected for 4 h with M. tuberculosis strain H37Ra. Uninfected PKH67-labeled green THP-1 cells (0.5 × 105 cells/ml) were added to infected macrophages for 24 and 48 h. Adherent cells were then stained with Hoechst 33342 and with TUNEL TMR (red) to determine apoptosis levels. Superimposition of PKH67-labeled (green) bystander cell fields and TUNEL-positive (red) fields showed bystander apoptotic macrophages (orange). Nuclear staining (blue) (not shown) revealed the total number of cells per field. One representative field at a magnification of ×20 is shown. The arrows indicate apoptotic bystander macrophages. (B) Close-up of apoptotic bystander macrophage (arrow).

2）文獻來源：Hellberg L, Fuchs S, Gericke C, et al. Proinflammatory stimuli enhance phagocytosis of apoptotic cells by neutrophil granulocytes. ScientificWorldJournal. 2011;11:2230-2236. doi:10.1100/2011/413271

PKH67染色目的（MKBIO）：50ul肝素化全血用TLR-ligands和細胞因子刺激30min，之后，將1 × 106PKH67標記好的凋亡自體中性粒細胞加入全血中，置于37℃孵育。60min之后，紅細胞用裂解液裂解掉，流式細胞術觀察中性粒細胞內凋亡細胞的吞噬水平。

Fig 3. Phagocytosis of apoptotic neutrophils by neutrophils in whole blood. 50?μL heparinized whole blood was preincubated with the indicated stimuli for 30?min and, subsequently, 1 × 106 PKH67 stained apoptotic neutrophils were added. Phagocytosis was assessed after 60?min by using flow cytometry. (a) Effect of TLR-ligands on the phagocytosis rate. (b) Effect of various cytokines on the phagocytosis rate. Data show mean + SD from 3 independent experiments, *:P < 0.05. (c)–(f) Representative dot-plots for the quantitative assessment of ingestion of apoptotic cells by neutrophils in whole blood by using flow cytometry. (c) FSC/SSC gating of neutrophils. (d) Negative control: gated neutrophils without apoptotic cells. (e) neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils. (f) Neutrophil phagocytosis of PKH67-labeled (green) apoptotic neutrophils after exposure to Pam3CSK4.

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— —Written/Edited by V. Shallan【版權歸MKBio懋康所有】

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